Иванец Т.А.
МЦ «Асклепий», г.Владивосток).
В лаборатории генодиагностики МЦ «Асклепий» с октября 1997 года выполняются работы по выявлению возбудителей вирусных и бактериальных инфекций методом полимеразной цепной реакции.
Для постановки метода ПЦР нами используются тест-наборы научно-производственной фирмы «ДНК- Технология», «Литех» и других фирм производителей, имеющих сертификаты.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была разработана К. Мюллисом в 1983 году, за что автор в 1995 году удостоен Нобелевской премии. Разработке метода ПЦР предшествовали выдающиеся открытия в области молекулярной биологии: во-первых, в 1971 году Kleppe с соавт. описал основные принципы использования коротких, искусственно синтезированных молекул ДНК (праймеров), во-вторых, появились приборы, позволяющие автоматически синтезировать одноцепочечные фрагменты ДНК, в-третьих, создание современной лазерной технологии сиквенирования (расшифровки нуклеотидных последовательностей ДНК), позволяющие определить до 5000 пар нуклеотидов в день и наконец, были обнаружены уникальные микроорганизмы, ферментная система которых (ДНК-полимераза) термостабильна, что позволяет сохранять ей свою активность при 95 0 и использовать её для проведения полимеразной цепной реакции.
Технология метода полимеразной цепной реакции
1. Принцип метода
Метод ПЦР основан на принципе естественной репликации ДНК, включающей: расплетение двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и комплементарное достраивание обеих нитей. В реакции участвуют искусственно синтезированный олигонуклеотид, повторяющий строение участка гена микроорганизма, и фермент Тag-полимераза. С помощью последнего происходит воспроизведение специфического фрагмента ДНК. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат матрицей для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации – это и есть цепная реакция. В результате 35-45 циклов амплификации из 1-10 копий ДНК нарабатывается до 108 копий фрагмента, достаточного для визуального учета реакции методом электрофореза в агарозном геле.
Методика проведения полимеразной цепной реакции предусматривает три этапа:
1. выделение ДНК из биологического материала
2. проведение полимеразной цепной реакции
3. электрофорез (детекция продуктов амплификации)
Этапы исследования проводятся с соблюдением «Правил устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы здравоохранения СССР», Москва, 1981г. Работа проводится в раздельных помещениях, снабженных отдельными комплектами пипеток, оборудованием, соответствующим образом маркированные, набором одноразовых пробирок и наконечников, перчаток, лабораторной одеждой, сменяемой при переходе из одного помещения в другое.
2. Характеристика набора
Каждый тест -набор состоит из 3-х комплектов: комплект №1 для выделения ДНК из биологического материала, комплект № 2 для ПЦР-амплификации ДНК, комплект №3 для детекции ДНК
3.Меры предосторожности.
Соприкосновение с исследуемым материалом происходит при выделении ДНК из биологического образца, при внесении ДНК в реакционную смесь, при детекции продуктов амплификации. Анализируемые образцы биологического материала являются потенциально инфицированным материалом, способным длительное время сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепатита В или С, или любой другой возбудитель инфекций. Работы с биологическим материалом проводятся с соблюдением санитарно-эпидемиологических правил (Санитарные правила 1.2.731-99). Все этапы работ проводятся в изолированных зонах.
4. Пробоподготовка (выделение ДНК)
В состав комплекта для выделения ДНК входят: буфер для лизиса, лизирующий раствор, сорбент. Обработка проб проводится в микроцентрифужных пробирках типа Эппендорф объемом 1,5 мл. Время обработки составляет 1,5 часа. Обработка проб включает центрифугирование, ресуспендирование осадка в лизирующем буфере, собственно из лизиса и депротеинизации образца с помощью протеиназы К с последующей очисткой пробы с помощью сорбента.
5. Проведение полимеразной цепной реакции.
Для постановки ПЦР используют комплект №2, включающий: ПЦР-буфер, смесь 4-х дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ), пару олигонуклеотидных специфических праймеров, фермент Таg – полимеразу, минеральное масло, парафин, копируемую ДНК. Ниже приведены краткие описания некоторых компонентов:
Праймеры - это короткие, длиной 20-30 оснований, одноцепочечные ДНК (дезоксиолигонуклеотиды), комплементарные копируемой ДНК- матрицы. Праймеры синтезируют соответственно консервативным участкам ДНК инфекционных возбудителей, которые редко подвергаются генетическим перестройкам. Поиски таких участков осуществляют при помощи специальных компьютерных программ.
Фермент Taq- полимераза, термостабильный фермент, присоединяясь к 3´-концам праймеров, достраивает их по принципу комплементарности до заданной длины в несколько сот или тысяч пар оснований.
Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) – дезоксиаденозинтрифосфат (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфат (дГТФ), дезоксицитозинтрифосфат (дЦТФ) и дезокситимидинтрифосфат (дТТФ) – «строительный материал», используемый Tag-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК.
Для повышения чувствительности и специфичности реакции предусмотрено применение «горячего» старта, который обеспечивается приготовлением реакционной смеси, состоящей из двух слоев: нижнего (ПЦР-буфер и праймер с дНТФ) и верхнего (ПЦР-буфер и Таg-полимераза), разделенных прослойкой парафина. Смешение слоев и превращение их в реакционную смесь происходит при расплавлении парафина на стадии денатурации. Материал исследуемого клинического образца вносят на реакционную смесь под стерильное вазелиновое масло, которое используется для предотвращения испарения ДНК во время проведения ПЦР. Пробирки помещают в термоциклер (амплификатор) и проводят реакцию амплификации. Изолированное умножение гена или его фрагмента называют амплификацией. Каждый цикл амплификации состоит из трех этапов: денатурации, отжига, элонгации (синтеза). На стадии денатурации реакционную смесь нагревают до 92-95º С, в результате чего двухцепочечные молекулы ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных молекул. На стадии отжига праймеры присоединяются к одноцепочечной ДНК-мишени. Отжиг происходить в соответствии с правилом комплементарности Чаргаффа: в двухцепочечной молекуле ДНК напротив аденина находится тимин, а напротив гуанина – цитозин. Температура отжига является специфической для каждой пары праймеров. После отжига праймеров Tag- полимераза начинает комплементарное достраивание второй цепи ДНК (синтез фрагмента –3-я стадия) с 3´-конца праймера. Образовавшиеся в первом цикле амплификации продукты синтеза служат матрицами для второго цикла амплификации. Повторяя 3 стадии 35-45 раз за 2-3 часа, получают миллионы копий специфического участка ДНК вируса, бактерий или клеток крови. Амплификацию проводят по заданной программе в автоматическом режиме. Время проведения реакции в зависимости от заданной программы и составляет 1ч20мин.-1ч.30мин.
Контроль реакции осуществляется одновременно с постановкой ПЦР. Положительный контроль включает в себя все компоненты реакции, но вместо материала клинического образца вносится контрольный образец – копии ДНК исследуемого возбудителя. Отрицательный контроль включает в себя все компоненты реакции, но вместо клинического материала включается соответственное количество деионизированной воды. Отрицательный контроль необходим, чтобы проверить компоненты реакции на отсутствие в них ДНК или клеток возбудителя и исключить ложноположительный результат.
6. Проведение электрофореза.
Для проведения электрофореза используют комплект № 3 для детекции ДНК (смесь для приготовления электрофорезного буфера, агарозный гель). Амплифицированный фрагмент выявляется электрофорезом в 1% агарозном геле в присутствии этидия бромида в течение 10 минут. Гель просматривают в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе. Положительный продукт амплификации виден в виде светящейся полосы ДНК желто-оранжевого цвета, который располагается на том же уровне, что и продукт положительного контроля. При отсутствии его в образце результат следует считать отрицательным.
В настоящее время метод ПЦР широко внедрен в практику здравоохранения и используется для диагностики вирусных и бактериальных инфекций. Метод ПЦР, «пройдя проверку временем, доказал экономичность и практическую эффективность» в использовании.
Преимущества метода ПЦР
1.Высокая специфичность метода ПЦР определяется:
-в исследуемом материале выявляют ДНК возбудителей вирусных и бактериальных инфекций, как наиболее устойчивую часть генома, не изменяющую свою антигенную структуру ни при каких обстоятельствах: длительный прием антибиотиков, действие защитных сил иммунной системы хозяина и др.;
-тест-наборы состоят из праймеров – синтезированных участков ДНК - состоящих из 30-50 олигонуклеотидных последовательностей, специфичных к каждому виду возбудителя. Использование таких наборов, в отличие от иммунологических тест-систем, позволяет избежать реакции, связанные с перекрестно-реагирующими антигенами и исключить ложноположительные результаты в ПЦР;
-для учета продуктов ПЦР используется электрофорез в геле. Исследование продуктов амплификации в клиническом образце проводиться параллельно с положительным и отрицательным контролями, что позволяет исключить ложноположительные результаты.
2. Высокая чувствительность.
Возможность накопления ДНК с помощью цепной реакции, проходящей в регулируемом термостате (амплификаторе), позволяет повысить порог чувствительности выделения микроорганизмов в исследуемом материале до 1-10 клеток по сравнению с другими методами, где он достигает 103-106 микроорганизмов в исследуемом материале.
3. Возможность анализа любого клинического материала (уретральные, цервикальные, глоточные соскобы, моча, мокрота, бронхоальвеолярный лаваж, биопсийный материал, содержимое пузырьков, корочки с подсыхающих везикул) не требующего определенных условий хранения и транспортировки. Исключение составляет материал для определения ДНК вируса гепатита В и РНК вируса гепатита С, где используется для работы свежевыделенная сыворотка от обследуемого.
4. ПЦР позволяет осуществлять диагностику латентных форм инфекции. Чувствительность выявления и идентификация возбудителей ИППП зависят от интенсивности течения инфекции, выраженности клинических симптомов, концентрации возбудителя в исследуемом материале, от состояния иммунной системы пациентов, биологических особенностей самих возбудителей. Многие бактерии и вирусы могут длительно находиться в латентной форме, присутствовать в мочеполовом тракте в малых количествах, изменять свою структуру под действием антибиотиков. Все вышеперечисленное затрудняет диагностику и снижает чувствительность и специфичность методов, основанных на иммунологических реакциях. Метод ПЦР, основанный на выявление ДНК, повышает возможность диагностики заболеваний, вызванных бактериальными и вирусными инфекциями.
5. Быстрота выполнения метода ПЦР. Определение возбудителя обычно осуществляется в течение одного дня. Использование амплификатора МС-2 ,производитель - «ДНК-технология», позволяет провести амплификацию в течение 1,5 часов, что сокращает время от начала обработки клинических образцов до получения результатов.
6. Возможность использования метода ПЦР для проведения скрининговых обследований неинвазивными методами. Высокая чувствительность метода, возможность исследования любого материала, в том числе мочи, позволяет всем желающим пройти скрининговое обследование без посещения кабинета гинеколога и андролога.
7. Метод ПЦР, как наиболее специфичный и чувствительный, может использоваться для оценки эффективности лечения ( критерий излеченности) больных. Известно, что после трёхнедельного курса приема доксициклина при лечении хламидиоза, возбудитель инфекции в урогенитальном тракте больных методом ИФА не выявляется, в то время как метод ПЦР позволяет его обнаружить. Для достоверности данных, 1-й контроль излеченности должен быть проведен не раньше чем через 1 месяц от окончания лечения, с последующим повторением через месяц.
8. Предупреждение ложноположительных результатов ПЦР. Чувствительность ПЦР может достигать математически возможного предела (детекции 1 копии ДНК- матрицы), поэтому существует высокая степень опасности получения ложноположительных результатов в силу переноса через предметы и реагенты как самой ДНК- матрицы (реже), так и амплификонов (очень часто), получаемых в больших количествах во многих пробирках в течение ежедневной работы. Причинами ложноположительных результатов являются следующие 3 вида контаминации:
1.Перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси), приводящей к появлению спорадических ложноположительных результатов;
2.Контаминация рекомбинантными плазмидами, содержащие клонированные последовательности детектируемого гена;
3.Контаминация продуктами амплификации (амплификонами) являются наиболее частой причиной ложноположительных результатов, поскольку в процессе ПЦР- диагностики амплификоны накапливаются в больших количествах и очень легко переносятся с аэрозолями и через приборы.
Соблюдение основных принципов организационной работы ПЦР-лаборатории, позволяет нам исключить возможности контаминации и, как следствие её, появление ложноположительных результатов.
Собственный опыт применения полимеразной цепной реакции
Проведена сравнительная характеристика двух методов полимеразной цепной реакции (ПЦР) и прямой иммунофлюоресценции (ПИФ), используемых в диагностике хламидиоза и уреаплазмоза.
С этой целью исследовали уретральные образцы, взятые путем соскоба у 134 мужчин с негонококковым уретритом. Положительный результат на хламидиоз методом ПИФ получен у 6,97% пациентов, а ПЦР – у 10,61% пациентов. Проведено 39 параллельных анализов. Результаты положительных находок совпали в 86,94% случаев. Методом ПЦР дополнительно обнаружено ещё 4 положительных образца. Исследования показали, что метод ПЦР повышает диагностику хламидиоза на 10,81%, , что свидетельствует о большей чувствительности и информативности по сравнению с методом ПИФ. При сравнении нами результатов тестирования урогенитальных образцов на присутствие Chlamydia trachomatis методами прямой иммунофлюоресценции и полимеразной цепной реакции, установили, что метод ПЦР повышает диагностику хламидиоза с 86,94% (ПИФ) до 97,7% (ПЦР).
Таким образом, наш опыт применения метода ПЦР показывает высокую чувствительность и специфичность данного метода, что позволяет его использовать для диагностики вышеназванных инфекций, особенно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью (труднокультивируемых и образующих L-формы), внутриклеточных, персистирующих микроорганизмов, а также для оценки эффективности проводимой терапии, контроля излеченности и скринингового обследования.
